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지베렐린
단백질 분리와 전기 영동
ECG의 개요와 심장의 구조
인플루엔자 바이러스에 대한 한의학적 약물실험
VIRUS에 대한 여러 가지 실험들
완충용액 (Buffer solution) 제조
Serum Protein
혈청 단백질의 전기영동
전기 영동법
단백질 정제
단백질 정량
광합성색소
PCR

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지베렐린 [gibberellin]

벼의 키다리병균에 의해 생산된 고등식물의 식물생장조절제.
1938년 벼의 키다리병의 병균인 지베렐라 푸지쿠로이(Gibberella fujikuroi)의 배양액에서 벼의 모를 웃자라게 하는 물질을 결정체로 분리하여 지베렐린 A라고 명명하였으며, 그것은 뒤에 A1, A2, A3 및 A4의 혼합결정이란 것이 밝혀졌다. 또 1954년 영국의 B.E.크로스, 1955년 미국의 F.H.스토돌라에 의해서도 독립적으로 분리되어 지베렐린산 및 지베렐린 X라고 명명되었다. 한편, 1958년 영국 J.맥밀런은 콩과 붉은강낭콩 Phaseolus multiflorus에서 새로운 지베렐린 A5, A8 및 A6을 A1과 함께 분리하였다. 이제까지 9종의 지베렐린이 알려졌다.
지베렐린(일반적으로는 지베렐린산의 칼륨염의 희석액을 쓴다)을 작용시키면 거의 모든 고등식물은 키가 현저하게 자란다. 이 작용은 지베렐린산이 가장 강하고, 다음에 A1, A4의 순이다.
지베렐린의 작용은,① 신장촉진작용, ② 종자발아촉진작용, ③ 개화촉진작용, ④ 착과(着果)의 증가작용, ⑤ 열매의 생장촉진작용 등이 있다. 또 실제면에서의 이용으로는, ① 섬유식물의 섬유를 길게 하여 그 생산량을 높이고, ② 꽃잎에 사용하면 2년초를 1년째에 개화시킬 수 있으며, ③ 채소의 수확시기를 빠르게 하여 그 증수를 도모하는데, 특히 셀러리에 있어서 이용가치가 크며, ④ 열매의 증수(씨없는 포도), ⑤ 감자의 증수(감자의 발아촉진과 증수) 등이 있다.
이 중 특히 지베렐린을 이용하여 씨없는 포도를 만드는 것은 유명하며, 금후 이 물질의 이용은 더욱더 발전할 것이다. 근래에는 벼의 키다리병균 이외에도 많은 식물에 이것이 존재한다는 것이 알려져 현재 14종에 이르며, 유리(遊雖) 또는 결합형으로 존재한다. 사람과 가축에는 독성을 나타내지 않는다.                                 http://100.empas.com/entry.html

잔대는 초롱꽃과의 숙근 다년생 초본식물로 전국 산야에 분포하고 있으며 생약명으로는 사삼으로 불리워 지고 있다. 주성분은 Saponin과 Inulin이 들어 있어 한방에서는 청혈, 거담, 강장 등에 사용되며 민간에서는 산후통의 특효약으로 이용되고 있는 한약제로 최근 수요량이 크게 증가하는 추세이다. 그러나 잔대를 재배하는 농가는 거의 없으며 자연산 채취에 의하여 수요량에 의존하고 있으나 최근 농촌 노동력의 급감으로 채취가 거의 안되어 공급량이 절대 부족하여 더덕이 잔대(사삼)로 오용되고 있는 실정이다. 따라서 잔대의 인공재배기술을 개발하기 위한 전단계의 기초실험으로 1993년 채종한 종자를 재료로 하여 저온 습윤처리, 고온 및 Gibberellin 처리를 한 후 발아기간중 명암조건, 발아온도 등을구명하여 잔대 종자의 발아율 향상을 위한 일련의 시험결과를 소개하고자 한다.

종자 성숙과정 및 종자 형태적 특성
잔대 종자의 성숙과정을 살펴보면 수정이 끝나고 24시간 후부터 꽃이 시들기 시작하면서 자방의 성숙이 시작되어 20일 전후까지는 녹색을 띄는데, 30일이 경과되면서 주피 표면이 부분적으로 연노랑색으로 변하며, 자방벽의 수분이 감소된다.
또한 종실은 수정후 40∼50일이 되면 표피의 납질이 두꺼워지고 딱딱해지면서 종피는 진갈색으로 변하여 완전 성숙한 형태로 진행된다. 잔대 종자 1,000립중을 경시적으로 관찰해 보면(표1) 개화 30일에 164mg, 40일에 247mg, 50일에 268mg으로 점차 증가하다가 60일 이후에는 종자가 과성숙하여 자연적으로 탈립되므로 잔대 종자의 수확은 개화후 50∼60일경이 적기라고 보여진다. 종자의 길이는 1.35mm, 폭 0.46mm, 두께 0.66mm로 아주 미세한 종자의 형태적 특성을 가지고 있다.

실생번식 방법
저온습윤, 고온 및 GA₃처리가 발아에 미치는 영향
잔대 종자의 발아율을 높이고 발아를 촉진시키기 위하여 종자를 2일간 물에 침종 시킨후 0℃, 5℃의 저온습윤처리 및 50℃의 고온에 각각 7일간 처리와 Gibberellin 100ppm에 24시간 침적처리후 Sodim hypochlorite 2%(시중에서 판매되는 락스 20cc를 물 1ℓ에 혼합)액에 5분간 침지 소독후 맑은 물로 2∼3회 세척한 뒤 25℃ 발아상에 치상하여 조사하였다(표2). 잔대종자의 발아과정은 치상후 3∼5일경에 유백색의 주근이 먼저 신장하고 5일 정도 지나면 뿌리의 길이는 1∼2cm 내외로 생장한다. 이때 섬모와 같은 잔털이 생기면서 자엽의 출현이 시작된다.
Gibberellin 100ppm 농도로 24시간 동안 침종하여 치상한 종자에서 발아율이 96.7%로 가장 높았으며, 평균발아일수는 3.8일로 빨랐고, 발아종자가 며칠만에 발아하는가를 나타내는 지표인 발아계수도 25.5%로 가장 좋게 나타났다.
또한 0℃저온에 7일간 습윤처리한 구에서는 발아율이 88.3%, 평균발아일수는 5.1일, 발아계수 17.3%로 양호하여 이는 상온에 보관한 무처리 종자의 발아율 40%, 평균발아일수 6.7일, 발아계수 6%에 비하여 높게 나타나 Gibberellin 100ppm처리와 0℃ 저온습윤처리 효과가 인정되었으나, 5℃ 저온처리구와 50℃ 고온처리구는 이들보다 저조하였다.

발아기간중 명·암조건이 발아에 미치는 영향
잔대 종자의 발아 기간중 명(1일 12시간)·암조건(1일 24시간)을 달리하여 광반응을 검토한 결과(표 3) 상온에 보관한 모처리 종자의 발아율은 24시간 암처리에서 전혀 발아하지 않았고, 명조건에서는 40%에 불과했었다. 0℃에서 저온습윤처리구는 명조건에서 88.7%이었으나 암조건에서는 35%이었고, Gibberellin 100ppm에서 24시간 침종처리한 구는 명조건에서는 96.7%, 암조건에서는 80.0%로 발아율이 높게 나타났는데 이는 광발아성 종자의 암발아시 Gibberellin 처리가 광대체 효과가 있다는 기존의 보고와 일치하였다. 이와 같은 점으로 볼때 잔대는 광발아 종자로 추정되었으며, 발아율을 향상시키기 위하여는 Gibberellin 100ppm에 24시간 침종처리한 후 파종하는 것이 효과적일 것으로 판단되었다.
또한 잔대 종자는 광발아 특성을 가지고 있고, 종자가 너무 작기 때문에(1,000립 268mg) 파종한후 복토하지 말고 진압해주는 것이 좋을 것으로 사료된다.

발아온도가 발아에 미치는 영향
다중항온기를 이용하여 발아온도를 10, 15, 20, 25, 30℃로 각각 조절한 다음 종자의 발아율을 조사한 결과는 그림 1과 같다. 잔대종자는 저온 보다는 고온에서 발아가 잘되는 작물로 10∼15℃에서는 발아율이 저조하나 20℃에서 75%로 발아율이 급격히 상승하며 25℃에서 가장 높은 발아율을 보였다. 따라서 외기 최고온도가 20℃되는 시기는 4월 25일 전후이기 때문에 이때를 파종기로 잡고 파종하는 것이 좋을 것으로 판단되었다.
* 종자처리 : 0℃에서 7일간 습윤처리(1일 12시간 명조건)
이상을 종합하여 보면 잔대 종자를 안전하게 발아시키기 위해서는 Gibberellin 100ppm에 24시간 침종한후 외기온도가 따뜻한 시기에 파종하는 것이 좋을 것으로 사료되며, 농가에서 Gibberellin 처리가 곤란할 때는 물에 침종한 종자를 냉장고 냉동실의 온도를 0℃로 조절하여 7일간 습윤처리 저장 한 뒤 꺼내어 파종하는 것이 좋을 것이다. 아울러 잔대종자는 너무 작고 광발아성 특성을 가지고 있기 때문에 복토하지 말고 진압해 주는 것이 좋을 것으로 판단되었다.                                                            http://www.nhri.go.kr/ddd/crop/vegetable/잔대.htm

단백질 분리와 전기 영동

단백질을 분리하는 방법은 분리하고자 하는 단백질이 무엇인가에 따라서 매우 다양하다. 단백질이 핵에 존재하는지 세포질에 존재하는지에 따라서, 또 단백질의 성질에 따라서 적당한 방법을 선택하여 써야 한다. 가장 처음에는 조직이나 세포로부터 핵 단백질이나 세포질단백질 또는 전체단백질을 분리하는 것으로 시작하며, 이로부터 수많은 정제과정을 거쳐야 원하는 단백질을 분리할 수 있다. 이 과정은 대단히 노력, 끈기, 자본을 요하는 것으로써 평생동안 한가지 단백질을 정제하는 과학자도 있음을 생각해야 한다. 여기에서는 정제되지 않은 단백질(hole cellular protein)을 분리하는 방법만을 소개하기로 한다. 물론 여기에도 수많은 방법이 있을 수 있다.

A. 배양세포로부터 단백질의 분리

1) 전체 세포단백질(whole cellular extract)의 분리
실험방법
1. 단층으로 자란 배양세포를 1 ml의 PBS로 두번 세척한다.
2. 배양접시에 붙은 상태로 얼음에 올려놓고 300 ml의 용해용액(RIPA 용액: 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% DOC[deoxycholic acid], 0.1% SDS, 50 mM Tris-Cl, pH 7.5)을 가한다.
3. 30분간 가끔씩 흔들면서 얼음에 둔다.
4. 1 ml pipette을 사용하여 수차례에 걸쳐 lysate를 올렸다, 내렸다를 반복하여 뻑뻑하지 않을 때까지 시행하면 genomic DNA가 모두 shearing 되었다고 볼 수 있다.
5. 이 용액을 미세원침관으로 옮기고 4°C,15,000 rpm에서 10분간 원심분리한다.
6. 상층액(세포단백질)을 새 미세원침관으로 옮긴다. 이 용액은 SDS-PAGE에 이용할 수 있다.

2) 핵단백질(nuclear extract)의 분리
핵단백질의 분리는 1단계의 핵분리과정과 2단계의 단백질 분리과정으로 나눌 수 있으며, 핵을 분리하는 방법에 따라서 여러가지 방법이 있다. 순수한 핵단백질을 원하는 경우 핵분리를 순수하게 해야 하지만 시간과 노력이 많이 들기 때문에 여러가지 세포에서 동시에 분리하기에는 어려움이 많다. 여기에 소개하는 방법은 Schreiber 등(1989)이 소개한 간단한 방법이다.
u 실험재료
용액 A: 10 mM HEPES, pH 7.9, 10 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 0.1 mM EGTA로 구성되고, 사용 직전에 DTT(dithiothreitol)을 1 mM로, PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride)를 0.5 mM로, 그리고 여러가지 protease inhibitor cocktail을 목적에 따라 만들어서 첨가하여 사용한다.
10% NP-40용액 C: 20 mM HEPES, pH 7.9, 0.4 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA로 구성되고, 사용 직전에 DTT를 1 mM로, PMSF를 1 mM로, 그리고 protease inhibitor cocktail을 첨가하여 사용한다.
1. 단층배양세포를 1 ml의 PBS로 두번 세척하고 0.5 ml의 PBS를 첨가한다음 policeman으로 긁어 미세원침관으로 옮긴다.
2. 4°C 원심분리기에서 15,000 rpm으로 1~2분간 원심분리한다.
3. 상층액을 제거하고 PCV(packed cell volumn)을 가늠해본다. 세포에 따라 다르지만, 10 cm 배양접시에 confluent 상태로 자란 세포(약 107)에서 시작한 경우 약 100 ml 정도 될 것이다.
4. 용액 A를 400 ml 넣고 부드럽게 pipette으로 풀고 약하게 vortex한 후, 얼음에 15분간 둔다. 이 과정에서 세포가 용해되기 시작한다. 핵막은 보존되는 상태이다.
5. 10% NP-40을 25 ml 넣고 10초간 세게 vortex한 후 4°C에서 15,000 rpm으로 1~2분간 원심분리. 상온에서 최고속도로 30초 원심분리하기도 한다.
u 세포의 종류에 따라서 NP-40의 농도를 변화시키는 것이 좋은데, 이를 넣지 않는 실험자도 많이 있다. 새로운 세포주를 사용할 때마다 NP-40을 첨가하기 전에 현미경으로 세포막의 파괴 유무를 확인하고, 이로부터 NP-40을 1 ml부터 조금씩 증가시켜보면서 현미경 관찰을 하여 조건을 정해주어야 한다.
6. 상층액을 버리고 침전된 핵의 부피(packed nuclear volumn, PNV)를 가늠해본다. 이를 50 ml의 용액 C에 풀고, 4°C에 설치된 shaker에서 비교적 강하게(level 6~7) 흔들면서 15분간 둔다.
7. 4°C 원심분리기에서 최고속도로 5분간 원심분리한다. 상층액이 핵단백질이다. 약간의 하얀 물질이 딸려올 수 있는데, SDS-PAGE 및 western blot 용으로는 큰 문제가 없다.
u 0.5~1.0´106 세포에서 출발한 경우 1~2 mg/ml 농도로 총 55~100 mg의 단백질을 얻을 수 있다.

B. 단백질의 정량

대표적으로 Bradford 방법과 Lowry 방법이 있는데, 여기서는 Bradford 방법을 간단하게 기술하기로 한다
실험방법
u 실험재료
Bradford 시약: 100 mg Coomassie brilliant Blue G-250을 50 ml absolute ethanol에 녹이고 100 ml of concentrated phosphoric acid를 넣은다음 증류수로 200 ml 까지 채운다. 이 용액은 6 x 의 상태로서 사용시에는 이 용액과 증류수를 1 : 5의 용량비로 섞은 후 filter paper로 1회 거른 후 사용한다.
표준용액원액: 10 mg/ml bovine serum albumin(BSA)를 주로 사용한다.

1. 미세원침관에 다음과 같이 표준용액을 만든다.

표준용액 번호	표준용액원액(ml)	증류수(ml)
1	0	2
2	5	15
3	10	10
4	15	5
5	20	0

u 이들의 최종 농도는 Bradford 시약을 1 ml(정확히는 980 ml) 첨가한 경우 각각 0, 5, 10, 15, 20 mg/ml이다.
2. 측정하고자 하는 단백질을 적당히 희석하여 증류수로 20 ml로 만든다. 예상되는 농도가 위 표준용액의 범위안에 있어야 한다.
3. 각 원침관에 모두 1 ml의 Bradford 시약을 넣고 잘 섞는다.
4. 10~30분 정도 두었다가 595 nm에서 흡광도를 측정하고, 표준용액을 이용하여 회귀방정식을 세우고 미지 단백질의 농도를 계산한다. 이때, 과정 2에서 희석한 것을 잊지 않도록 한다.

C. 단백질의 전기영동(SDS-PAGE)

Acrylamide gel은 DNA 또는 단백질의 전기영동에 이용될 수 있는데, 특히 단백질의 경우는 SDS (sodium dodecyl sulfate)를 포함한 SDS-PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis)를 실시한다. Polyacrylamide gel은 acrylamide 측쇄 기능기가 N, N'-methy-lenebisacrylamide와 같은 2개의 기능기를 가지는 화합물에 의해 교차연결(cross-link)되어 형성된 polymer이다. SDS-PAGE의 효과적인 분리 범위는 polyacrylamide의 농도와 교차연결 정도에 의해 결정되며 교차연결시키는 물질이 없는 상태에서 형성된 acrylamide polymer는 쓸모없는 점액성 용액을 이루게 된다.

표 1. SDS-polyacrylamide gel의 효과적 분해 범위

Acrylamide concentration(%)	Linear range of separation(kDa)
15	12~43
10	16~68
7.5	36~94
5.0	57~212

Bisacrylamide에 의해 교차연결되어 생긴 gel은 gel 자체의 강도와 탄성을 유지하고 SDS-polypeptide가 통과할 작은 구멍을 형성한다. 이 구멍의 크기는 bisacrylamide:acrylamide의 비율이 증가할수록 감소하여 약 1:20 정도에서 가장 작게 된다. 대부분의 SDS- polyacrylamide gel은 1:29의 몰비율로 제조하며 이 비에서 분자량이 3% 정도의 차이가 있는 polypeptide를 분리할 수 있다.

Disc gel 전기영동의 원리
보통 SDS-PAGE는 두가지의 다른 gel이 붙어있는 상태인 Disc(discontinuous pH 또는 disc) gel 전기영동으로 시행하게 된다. 이를 사용하면 단백질 시료가 gel에 apply되었을 때 모든 시료가 같은 점에서 출발할 수 있도록 압축이 되고, 그다음에 성질에 따라 분리되게 된다. 따라서 두 gel의 농도나 pH가 다르게 설정되어 있다.
윗부분의 gel은 stacking gel이라 부르며, acrylamide 농도는 주로 3~5%이고 pH는 running gel보다 2 정도 낮은 6.5를 주로 쓰게된다. 아래의 gel은 running gel, resolving gel, separating gel 등으로 불리며, acrylamide 농도는 분리하고자 하는 단백질의 크기에 따라 6~15%를 주로 사용한다.
Gel의 윗부분 완충용액(upper chamber buffer)의 glycine은 아미노산의 성질로 인해 음전하를 띠거나 net charge가 0인 zwitter이온 형태로 존재한다.Gel에 형성된 well에 단백질 시료를 가하고 전기영동을 시작하면 Cl-이온과 단백질, glycine-이온이 모두 +극을 향해 출발하게 된다(Zwitter이온은 움직이지 않는다). 그런데 Glycine-은 stacking gel의 낮은 pH에서 다시 평형을 이루어 일부가 zwitter이온이 되어버리기 때문에 이부분에서 움직이는 이온(mobile ion)이 없어지고, 결과적으로 전류가 감소하게 된다. 그러나 전체 gel 시스템의 전류는 유지되어야 하므로 이를 극복하기 위해 Cl-이온과 glycine-이온 사이에 매우 높은 전압차가 형성된다. 이때 상대적인 이동속도는 glycine- < 단백질 < bromophenol blue < Cl-이 된다(Cl-는 작기 때문에 빠르고, 단백질은 glycine보다 크지만 음전하가 많아서 빠르다). 모든 단백질은 acrylamide 농도가 낮은 gel에서 움직임의 제한을 받지 않고 높은 전압차에 의해 빠르게 이동하지만, Cl-이온 앞쪽이나 glycine-이온 뒤쪽으로는 높은 전압이 없으므로 이 사이(얇은 disc)에 모두 모여 이동되는 셈이다. 이들이 resolving gel에 도달하면 이곳에서 glycine은 높은 pH로 인해 거의 모두 음전하가 되어 위와같은 효과는 사라지고, 또한 acrylamide의 농도가 높기 때문에 단백질은 크기에 따라서 분리가 시작되게 된다.

1) SDS-polyacrylamide gel의 준비
실험방법
u 실험재료
29% acrylamide, 1% bisacrylamide 용액 0.5 M Tris (pH 6.8), 1.5 M Tris (pH 8.8), 10% SDS, Water-saturated butanol
1x SDS gel-loading 완충용액 (50 mM Tris-Cl, pH 6.8, 100 mM dithiothreitol, 2% SDS, 0.1% bromophenol blue, 10% glycerol): 6x로 만들어 쓰는 것이 편하다ris, 250 mM glycine pH 8.3, 0.1% SDS): 5x 또는 10x로 만들어두고 희석하여 사용하는데, 10x 용액은 Tris 30.2 g, glycine 188 g을 900 ml 증류수에 녹인 다음 10% SDS 용액을 100 ml 가하고 증류수로 1 liter까지 채워서 만든다.
1. 기구 제조회사의 조립설명에 따라 기구(Mighty)를 조립한다. Casting 되어 있는 유리판 사이에 comb을 미리 꼽아 보고 comb의 밑부분에서 약 1 cm 밑으로 선을 표시한다.
2. 표 2를 참고하여 Stacking gel과 running gel(10%)의 용액을 혼합한다. Mighty gel의 한판에 running gel 5 ml과 stacking gel 2 ml이 소요된다.
3. Comb을 제거하고 running gel 용액에 15 ml의 30% ammonium persulfate와 3 ml의 TEMED를 첨가한 후 거품이 나지 않을 정도로 신속히 섞고 pipette을 사용하여 조심스럽게 유리판 사이의 공간에 붓는다.
4. 가한 gel mixture의 높이가 미리 표시한 선까지 도달하면 증류수로 포화된 n-butanol을 조심스럽게 약 500 ml정도 가한다
(이때 가하는 양은 정확하지 않아도 되며 n-butanol이 gel의 상부를 전부 덮으면 된다). Gel이 굳을 때까지 약 30분간 방치한다.
5. Gel이 굳으면 상층에 가한 n-butanol과 acrylamide사이가 뚜렷하게 구분되게 된다. 상층액인 n-butanol을 기울여서 버리고 증류수로 수차례 세척하고 filter paper를 사용하여 완전히 제거한다.
6. Stacking gel 용액에 7 ml의 30% ammonium persulfate와 2 ml의 TEMED를 첨가한 후 거품이 나지 않을 정도로 신속히 섞고 pipette을 사용하여 조심스럽게 유리판 사이의 공간에 붓고 comb을 설치한다.
7. Stacking gel이 굳는 동안 1x SDS gel-loading 완충용액이 들어 있는 시료를 100°C에서 3분간 가열하여 단백질을 변성시킨다.
8. Gel이 다 굳으면 조심스럽게 comb을 제거한 후 주사기의 증류수로 gel 형성이 안된 찌꺼기를 제거한다.
9. 굳힌 gel을 전기영동 기구에 장치하고 위와 아래 완충용액 통에 전기영동 완충용액을 붇는다.
10. Gel 홈에 시료를 가한다. u 사용하지 않는 홈에도 시료와 같은 용량의 1x SDS gel-loading 완충용액을 가하는 것이 좋다.
11. 전기영동 기구를 전원에 연결시킨 후 gel의 전기장이 8 V/cm이 되게 전압을 건다.
12. Bromophenol blue가 resolving gel에 도달하면 15 V/cm으로 전압을 올리고 bromophenol blue가 resolving gel의 끝까지 갈 때까지 전기영동을 실시한다.
13. 전기영동이 끝나면 전기영동 장치로부터 유리판을 분리한 후 paper towel 위에 놓는다.
14. 유리판을 gel로부터 분리한 후 gel의 왼쪽 위 모서리에 표식을 남겨 방향을 알 수 있게 한다.
15. Gel을 고정하거나, Coomassie brilliant blue로 염색하거나, 형광사진의 촬영 또는 Western blot 등 용도에 따라 이용한다.
u Acrylamide와 bisacrylamide는 피부로 흡수되어 매우 강력한 신경독성을 나타내며 이 효과는 축적되기 때문에 무게를 잴 때는 장갑과 마스크를 차용해야 한다. 일단 굳은 polyacrylamide는 무해하다고 여겨지지만 polymer 형성이 안된 acrylamide 또는 bisacrylamide monomer가 남아 있을 수 있으므로 조심스럽게 다루어야 한다.
u Resolving gel과 stacking gel의 완충용액은 Tris 염으로 만드는 것이 중요하다. 증류수로 Tris를 녹인 후에는 용액의 pH를 반드시 맞춘 후 사용하여야 한다. 완충용액 제조시 Tris-HCl이나 Trizma를 사용하였다면 염의 농도가 너무 높아서 polypeptide가 비정상적으로 이동하여 널리 퍼진 띠모양을 형성하게 된다.
u TEMED(N, N, N', N'-tetramethylethylenediamine)는 ammonium persulfate로부터 생기는 자유 반응기(free radical)의 생성을 촉매하여 acrylamide와 bisacrylamide의 polymer 형성을 촉진시킨다. TEMED는 자유염일 때에만 작용하므로 낮은 pH에서는 polymer 형성이 방해를 받는다.
u Ammonium persulfate는 자유 반응기를 생성하여 acrylamide와 bisacrylamide의 polymer를 형성시킨다. 증류수로 30%(w/v) 저장용액을 만들어 여과하고 작은 부피로 나눈 후 4°C에 보관하며, 시간이 지남에 따라 서서히 분해되므로 1~3주가 지나면 새로 만들어 사용하는 것이 좋다.

2) Coomassie brilliant blue로 SDS-polyacrylamide gel의 염색
실험방법
1. 0.25 g의 Coomassie brilliant blue R250을 10% acetic acid, 45% methanol 혼합용액(staining solution)에 녹인 후 덜 녹은 시약을 제거하기 위해 Whatman 1번 여과지로 거른다.
2. Gel을 적어도 5배 부피에 해당하는 염색액에 담근 후 염색이 충분히 될 때까지 서서히 흔들어 준다.
3. 염색액을 제거한 후 염색약이 포함되지 않은 10% acetic acid, 45% methanol 용액(destaining solution)에 gel을 담가 둔다
4. 탈색용액을 여러차례 갈아 주면서 관찰한다. 보통 24시간 탈색을 하면 단일 띠로 0.01 mg의 단백질까지 찾아낼 수 있다.
5. 탈색 후 gel은 물이 담겨진 플라스틱 백에서 염색된 정도의 변화없이 무한정 보관할 수 있다. 그러나 저장기간 중 고정된 polyacrylamide gel은 물에 의해 부풀거나 변형될 수 있으므로 이러한 문제를 없애기 위해 고정된 gel을 20% glycerol이 들어 있는 물에 저장을 한다. 염색된 gel은 탈색용액에 저장하면 단백질 띠가 사라질 수 있으므로 탈색용액에 저장해서는 안 된다.
6. 영구적인 자료로 사용하기 위해 염색된 gel의 사진을 찍거나 gel을 말린 후 보관한다.

3) 은염(Silver salts)으로 SDS-polyacrylamide gel의 염색
SDS-polyacrylamide gel 전기영동에 의해 분리된 polypeptide를 은염으로 염색하기 위하여 여러가지 방법이 개발되었다. 그 방법은 모두 아미노산의 기능기에 결합하는 은 이온의 환원차를 이용한 것이다. 이들 방법은 암모니아를 처리한 은(ammoniacal silver) 용액을 사용하는 방법과 질산은(silver nitrate)을 사용하는 방법으로 크게 나눌 수 있다. 두가지 방법 모두 Coomassie blue에 비해 100에서 1,000배 예민하여 0.1∼1 ng의 polypeptide까지 단일 띠로 찾을 수 있지만 암모니아 처리은에 비하여 질산은의 경우가 제조하기가 더 쉽고 폭발성의 부산물을 만들어내지 않는다.
실험방법
u 실험재료
0.1% silver nitrate 용액: 잘 막힌 검은 갈색병에 들어 있는 20% 저장용액을 희석하여 새로 만들어 사용한다.
2.5% sodium carbonate, 0.02% formaldehyde 혼합 용액
1. Gel 부피의 최소한 5배되는 양의 10% acetic acid, 30% methanol 혼합용액에 gel을 담고 실온에서 4∼12시간 서서히 흔들어주면서 전기영동한 단백질을 고정시킨다.
2. 고정 용액을 버리고 최소한 5배 부피의 30% ethanol을 가한 후 실온에서 30분간 서서히 흔들어 준다.
3. 2번 과정을 한차례 반복한다.
4. Ethanol을 버리고 10배 부피의 증류수를 가한 후 실온에서 10분간 서서히 흔들어 준다.
5. 4번 과정을 한차례 반복한다. 이 과정에서 gel이 물에 의해 부풀 수 있다.
6. 증류수를 제거하고 장갑을 낀 후 gel의 5배 부피의 0.1% 질산은 용액을 부은 후 실온에서 30분간 서서히 흔들어 준다.
7. 질산은을 버리고 증류수로 gel의 양쪽 끝을 각각 20초씩 씻는다. 이 때 gel 표면이 마르지 않도록 주의한다.
8. 5배 부피의 새로 만든 2.5% sodium carbonate, 0.02% formaldehyde 혼합용액을 가한 후 실온에서 서서히 흔들어주면서 gel을 조심스럽게 관찰.
u 수분내에 염색된 단백질 띠가 나타나야 하며 원하는 대조가 얻어질 때까지 염색을 한다.
u Formaldehyde의 증기는 독성이 있으므로 이를 포함하는 용액은 hood에서 만들어야 한다.
u 염색 시간이 길면 gel 자체가 염색되며 배경이 좋지 않다.
9. 수분동안 1% acetic acid를 가하여 반응을 끝내고 gel을 증류수에 10분씩 여러차례 세척한다. 때때로 반짝이는 회색의 은막이 gel 표면에 형성되며 이것은 4배 희석된 사진 현상용액에 2∼3초 세척함으로써 쉽게 제거될 수 있다.
10. Gel을 말려 보관한다.

H 참고사항
사진 현상 용액은 다음과 같이 제조한다.
1) 용액 A : NaCl 37 g과 CuSO4 37 g을 850 ml 증류수에 녹인다. 짙은 푸른 침전이 생긴 후 다시 녹을 때까지 농축 암모니아를 가한 후 부피를 1 liter로 희석한다.
2) 용액 B : Sodium thiosulfate 436 g을 증류수에 녹여 1 liter로 만든다.
3) 같은 부피의 용액 A와 B를 혼합한 후 혼합용액의 3배 부피 증류수에 희석한 다음 즉시 사용한다.

4) SDS-polyacrylamide gel 말리기
[35S]로 표시된 단백질을 포함하고 있는 SDS-polyacrlamide gel은 자가방사법에 의한 사진을 얻기 위해 반드시 먼저 말려야 한다. Gel을 말리는 과정에 어려운 점 두 가지는 gel이 쪼그라들면서 변형되는 것과 금이 가는 것이다. Gel을 말리기 전에 Whatman 3MM 종이에 부착시킴으로써 gel이 쪼그라드는 것을 방지할 수 있으나 금이 가는 것을 방지할 수는 없다. Gel이 polyacrylamide를 많이 함유하고 두꺼울수록 갈라짐이 심해지므로 진공 압력의 변화가 적은 좋은 품질의 gel 건조기를 사용하여야 하며 가능한 한 얇은 gel을 사용하도록 한다. Gel이 갈라지는 것은 gel 건조기에서 수분이 완전히 제거되기 전에 gel을 건조기에서 꺼내는 경우 잘 일어나므로 주의를 요한다.
1. Gel을 전기영동 기구에서 떼어낸 후 실온에서 5∼10배 부피의 10% acetic acid, 30% methanol 혼합용액에 고정시킨다.
u Bromophenol blue는 산성 고정 용액에서 노란색으로 변하여 gel에 퍼지게 된다. 처음색이 완전히 사라진 후 5분 정도 고정액에 놓아둔 후 gel을 증류수에 세척한다.
2. Gel보다 약간 더 큰 비닐 랩 위에 gel을 놓고 오른쪽 아래 모서리에 표시를 한다.
3. 습기가 있는 gel 위에 Whatman 3MM 종이를 놓는다. 종이는 gel의 가장자리보다는 약간 더(1∼2 cm) 크고 gel 건조기보다는 작게 준비를 한다.
u Gel에 한번 붙은 3MM 종이를 다시 움직이게 하면 안된다.
4. 다른 3MM 종이를 gel 건조기의 표면에 올려놓는다. 이때 종이는 gel 전체를 올려놓기에 충분하게 준비를 한다.
5. 2∼3 번에서 준비한 3MM 종이/gel/비닐랩을 포개어 건조기의 3MM 종이 위에 놓는다. 이때 비닐랩이 제일 위에 위치하도록 한다.
6. 건조기의 덮개를 덮어 진공이 완전히 걸리게 한다. 건조기에 전열기가 달려있는 경우 gel을 빨리 말리기 위하여 50∼80°C로 가열한다.
7. 건조기의 제작사에서 권장하는 시간동안 gel을 말리며(보통 0.75 mm 경우 2시간) 가열하면서 말릴 경우에는 진공을 풀기 수분전에 가열을 중지하여야 한다.
8. 3MM 종이에 달라붙은 gel을 건조기로부터 분리해 낸다.
9. 비닐랩을 제거한 후 자가방사하기 위해 암실에서 필름에 감광시키거나 실험자료로 보관한다.

Structure of the Heart and Arteries (ECG의 개요와 심장의 구조)(2000. 11. 9)

심전도 검사는 심장의 활동을 조절하는 전기적 충격을 기록하여 조사하는 검사입니다. 전극을 피부에 붙이기만 하면 되기 때문에 통증은 없고 전극을 부착하는 부위를 미리 정해 그것을 조합하여 측정합니다. 필요하면 운동부하 검사를 할 수도 있습니다. 심장내에서 일어나는 전기적 변화를 담아서 기록 용지와 스크린에 표시하는 것으로, 이것이 심전도(ECG)입니다. 이 검사는 심장 활동의 유형이 조금만 변화해도 이를 예민하게 포착하므로, 여러 가지 심장질환의 검사에 이용됩니다. 24시간 심전도 검사는 심전도를 24시간 계속 기록하여, 심장박동 리듬의 이상 유무를 확인하는 검사입니다.
(심장근육이 활동할 때에 발생하는 활동전위를 심전계를 이용하여 신체표면에서 도출하여 Graph로 그려내어, 부정맥의 병리, 심근장애, 심근경색의 진단 등 각종 심장질환을 진단 규명하는 것으로 심전도의 검사의 임상적 의의는 다음 8가지로 정할수 있다. 1) 부정맥(Arrhythmia), 2) 심방 및 심실 비대, 3) 심근허혈 및 심근경색, 4) 심낭염, 5) 심장에 영향을 주는 질환·갑상선 질환·폐질환, 6) 심장약의 효과, 7) 전해질 대사의 이상, 8) 인공심박조율기의 기능의 평가)
심장은 3차원적인 구조이며 myocardium 을 따라서 퍼지는 depolarization wave 도 3차원적으로 나타나게 됩니다. 그러므로 심장의 (주로 myocardium 의) 전기적인 활동을 알기 위해서는 여러 방향으로 전극들을 놓고 시간에 따른 전압을 측정할 필요가 있습니다. frontal plane 에서는 사지에 전극을 연결하여 6 방향의 전압을 측정하므로 이를 limb lead 라고 하며 horizontal plane 에서는 앞가슴에 전극을 붙여서 6 개의 전방 방향의 전압을 측정하므로 이를 precordial lead 라고 합니다.

상황에 따라서 다음과 같은 lead가 쓰입니다.
Right precordial lead : V3R, V4R 등으로 표시됩니다. 우심실경색 (right ventricular infarction) 의 진단에 유용합니다
Lewis lead : P wave 가 잘 보입니다. RA at 2th ICS, Rt sternal margin, LA at 4th ICS, RT sternal margin, record I
MCL lead (modified chest lead, for monitoring in CCU) V1 (+), left shoulder (-), right shoulder (ground) Similar to V1
Esophageal lead

Concept of vector
wavefront 를 그리면서 퍼저나가는 각 depolarization wave 는 강도와 방향이 있으므로 벡터로 생각할 수 있습니다. 체표면에서 기록되는 ECG 는 각 myocardial fiber 에 생기는 모든 depolarization 및 repolarization wave 벡터의 합의 시간에 따른 변화를 그린 것이라고 할 수 있습니다.
Vector ECG 는 임상에서는 별로 쓰이지 않으나 ECG 의 이해에 매우 중요한 개념입니다. 또한 이는 ECG 의 sensitivity 나 specificity 가 높지 못한 이유를 설명합니다. 즉 myocardium 일부의 벡터가 비정상이더라도 전체 벡터의 합에서는 가려지기 때문에 국소적인 전기적 이상이 어느 정도 이상 있어야 전체 벡터에서 이상이 나타나게 되어 체표면 ECG 에서 나타나게 되거나 국소적인 벡터가 정상이라도 반대방향의 벡터의 이상으로 비정상소견처럼 보일 수 있는 것입니다.

Concept of electrical axis
ECG 의 각 lead 에서 얻은 wave vector 를 합성하면 P, QRS, T wave 등 특정 wave 의 전체적인 vector 를 얻을 수 있습니다. 이것이 electrical axis 입니다.
정상적으로 electrical axis는 대략 아래쪽, 왼쪽, 앞쪽을 향하나 여러 병적인 상황에서는 이 방향이 달라지게 됩니다. 그러나 electrical axis 가 돌아갔다는 것은 전기적인 현상의 기록일 뿐 실제 해부학적인 심장의 방향이 돌아가 있다는 뜻이 아닙니다. 심장이 정확히 몸의 중심에 있는 것이 아니고 또 병적인 문제 외에 개인적인 차이나 흉곽 등 심장질환 외의 이유로 electrical axis 가 변할 수 있습니다.
심장과 체표면의 거리는 전기적인 강도에 영향을 줍니다. limb lead 는 거리가 멀어서 영향을 별로 받지 않으나 precordial lead 는 epicardium 과 거리가 가까우므로 흉벽의 두께나 전기적인 전도도 등의 영향으로 전기적인 강도가 변할 수 있습니다. 예를 들면 만성폐색성폐질환 환자는 precordial lead 가 low voltage 입니다.
체격이나 연령에 따라서도 electrical axis 가 변합니다. 마른 체격에서는 axis 가 비교적 수직으로 전방을 향하며, 흉곽이 큰 체격에서는 axis 가 수평으로, 왼쪽으로 돌아가는 경향이 있습니다. 출생시 axis 는 right axis deviation 이나 점차 왼쪽으로 돌아서 성인과 같은 axis 가 되는데 이는 연령에 따라서 계속해서 점차 왼쪽을 향하는 경향이 있습니다.

혈액의 흐름
상대,하대정맥-우심방-삼첨판-우심실-반월판(pulmonary semilunar valve)-폐동맥-폐-폐정맥-좌심방-이첨판-좌심실-반월판(aortic semilunar valve)-온몸-상대,하대정맥
ㄱ.혈액을 받아들이는 곳:좌심방, 우심방, 혈액을 내보내는 곳:좌심실, 우심실(심실벽이 심방벽보다 두껍게 발달되있다.)
ㄴ.동방결절:우심방과 대정맥 사이 심장벽에 위치해있다. 신경조지과 운동조직 2가지 성질을 모두가지며 주기적으로 흥분을 일으키며 심방의 근육을 수축시킨다.
ㄷ.방실결절:우심방과 우심실사이에 위치해있다. 동발결절의 흥분을 히스색과 푸르키네 섬유로 전달한다.
ㄹ.히스색, 푸르키네섬유:좌우 심실벽에 뻗어있는 특수한 근섬유로써 자극 전도계라고 한다.

인플루엔자 바이러스에 대한 한의학적 약물실험

I. HA ( Hemagglutination Assary )
PBS ( 완충용액 : phosphate buffered saline )를 microtiterplate ( U-form ) 에 0.025ml 씩 분주.
피펫으로 0.030ml의 바이러스를 1열에 넣는다.
계단희석 ( 왼쪽이 고농도의 바이러스 )
RBC를 0.050ml 씩 투여.
약한 Vortex.
응집 상태를 본다.

Ⅱ. HIT ( Hemagglutination Inhibition Test )
PBS를 0.025ml씩 균일 투여.
시약들 ( 약물들 ) 을 1열에 0.050ml씩 투여.
계단희석.
바이러스를 0.025ml씩 균일 투여.
약한 Vortex.
RBC를 0.050ml 씩 균일 투여.
약한 Vortex ( 심하면 RBC가 깨지므로 주의 )
응집 상태를 본다.
-만약 시약들이 바이러스와 결합했다면 RBC와 결합하지 않은 상태로 약물효과가 있다는 증거가 된다. 그냥 침전 -만약 시약들이 바이러스와 결합하지 않고RBC와 결합하여 엉기었다면 약물효과가 없고 인체에 피해를 준다는 증거가 된다.
※PBS+약물+RBC의 실험으로 증명가능. 실험 순서에 따라 결과가 틀려 지므로 유의
※PBS ( Nacl 8g + Na₂HPO₄1.15g + Kcl 0.2g + KH₂PO₄0.2g + DW1ℓ) ph 7.2의 완충용액.
※RBC : 닭,인간, 기니아의 피를 채취하여 항응고제가 들어있는 캡슐에 넣어 8자로 섞어준다. 이것을 원심분리하여 하층부의 적혈구를 추출한다. ( PBS를 첨가해가면서 상층액이 투명해질때 까지 여러번 centrifuge를 한다. 보통3번 정도 ) 강한 원심분리나, Vortex, 잦은 피펫팅은 적혁구를 파괴하여 실험 결과에 많은 영향을 미치므로 유의하여 실험한다.
※강한 활성이나 약한활성의 차이에 유의하여야 하며 Negative는 변화가 없어야한다.

VIRUS에 대한 여러 가지 실험들

Ⅰ. Virus infection.
Culture 중인 cell을 10ml 정도 뽑아 T.C dish에 분주 후 평편한 곳에서 2hrs정도 attachment.
--- dish바닥에 70 - 80%가 깔리는 상태의 cell이 가장 좋다. cell상태는 200* 현미경하에서 organelles가 보이지 않는 상태가 가장 좋다. 만약 cell수가 적으면 1-2일 정도 overnight culture 한다
상층의 media를 버린다. ( virus가 cell에 infection되는데 방해가 되므로. )
virus를 5m이 되게 감염시킨다. 분주 후 inverting.
1시간 infection 시키는데 15min간격으로 inverting.
28℃에서 4-5일 방치 ( 편평한곳 ) infection 후 1일 경과하면 현미경 하에서 polyhedra형성이 관찰되기 시작 한다.

Ⅱ. Cell counting.
preparation : Splited cell , Hemocytometer , Slide glass , cover glass , staining solution-tryphan blue, E-tube..
grown cell을 transfer해서 한곳에 모은 후 15ml cornical tube에 옮겨서 1000rpm으로 5min간 centrifuge.
SNT를 discard하고 10% 배지로 pellet을 pipetting하여서 잘 풀어준다.
E-tube에 cell을 100㎕넣고 staining solution을 동량 넣은 후, 잘 섞어서 Hemocytometer에 20㎕ 넣어서 염색된 cell만 counting.
분석 C=N/V C : cell concentration , N : number of cells counted , V : volume.
C( number of total cells ) = C*10⁴( hemocytometer size가 0.1mm³ 혹은 1/10⁴ml ) * volume of total splitted cells * 2

Ⅲ. Cell transfer.
preparation : Monolayered cell , 10% serum media 37℃warming , Trypsin-EDTA , PBS..
flask에서 old medium을 버린다.
PBS 5ml 로 washing ( serum이 trypsin의 작용을 방해 하므로 )
Trypsin-EDTA 2ml ( 75㎠flask-25㎠는 1ml )처리하고 vero cell 은 40초 ,
BHK cell은 15초 기다린 후 cell이 둥근 형태로 되었을 때 trypsin-EDTA 제거.
flask를 쳐서 완전히 cell을 떨어트린다.
10% MEM배지로 cell을 바닥에 pipetting하여서 cell을 분리해 낸다.
1 : 2 , 1 : 3 , 1 : 5 의 비율로 new flask에 옮긴다.
total volume을 15ml이 되게 new medium을 채운 후 CO incubater에서 배양.

Ⅳ. Plaque assay
Falcon tissue culture plates에 ( 60*15mm ) SF cells를 떨어트린다.
( 3 * 1000000 cells / plate ). 5ml TC-100 medium에 containing.
1% tryptose broth and 8% fetal calf serum and left O/N at 27℃ humidified incubater.
감염 후 0.5% agarose overlayer를 준비한다. The 5% agarose in D.W(W/V) was autoclaved at 15LBS for 15min and then placed in 45℃ water bath. After cool-down to 45℃, the 5% agarose was diluted to 1 : 10 in prewarm TC-100 medium and kept at the water bath.
After allowing one hour adsorption, 3ml of the 0.5% agarose medium was overlayed and another 2-3ml of the agarose medium was refed at 2days post -infection.
The plates were incubated at 27℃ for 4-5 days, and then 0.01% neutral red - agarose medium was overlayed to read plaques for 12-15hrs.
The plaques were counted.

완충용액 (Buffer solution) 제조

1. 정의와 의의
완충작용이 큰 용액을 완충용액 이라하며, 아세트산-아세트산염, 염화수소산-시트르산나트륨 등, 일반적으로 약한 산이나 약한 염기와 그 염 등을 적당히 혼합함으로써, 여러 가지 pH값에 있어서의 완충용액을 만들 수 있음. 시료 등의 pH를 일정하게 유지하기 위하여 첨가할 때 쓰이고, 또 pH 측정 때 비교 표준액으로서 씀.

2. 측정원리
용액에 산이나 염기를 가할때 일어나는 수소이온 농도의 변화를 작게 하는 작용에 쓰임.
KH2PO4에 NaOH 를 넣어 PH=7로 만든다. NaOH 용액에 Na2B4O7 10H2O 용액을 넣어 PH=7로 만든다.

3. 필요한 시약
① 0.1M의 KH2PO4 50㎖ → KH2PO4 은136.09g이 1M 이므로 0.1M 이면 13.609g에 증류수를 부어 1ℓ가 되게한다. 또는 6.8045g에 증류수를 채워 500㎖가 되게하면 된다.
② 0.1M NaOH용액 47.4㎖ → NaOH 40g이 1M 이므로 0.1M 이면 4g에 1ℓ되게 붓던가, 2g에 500㎖가 되도 록 증류수를 넣으면 된다.
③ 0.025M Na2B4O7 10H2O 50㎖ → 381.87g이 1M 이므로 1/40M 이면, 381.87/40=9.534g에 증류수를 채워 1ℓ가 되 게한다. 즉 4.767g에 증류수를 채워 500㎖가 되게한다.

4. 필요한 기구 및 장비
① 피펫 3개 ② 메스 플라스크 ③ 비이커 ④ 둥근 플라스크 ⑤ 전자저울 ⑥ 삼각 플라스크 ⑦ pH 메타

5. 실험절차

< pH = 7 >
① 0.1M의 KH2PO4 (136.09g) 용액 50㎖에 0.1M의 NaOH 용액 29.1㎖를 넣는다.
< pH = 10 >
② 0.1M NaOH 용액 18.3g을 0.025M Na2B4O7 10H2O 용액 50㎖에 넣는다.
③ pH메타에 넣어 측정한다.

6. REVIEW
PH=7 과 PH=10을 측정 했는데 정확한 값을 얻지는 못했다. PH는 미세한 산, 염기의 변화에도 PH가 정확하지 않게 나오기 때문에 용액을 잴때 전자저울로 정확히 재어야만 만들고자 하는 완충용액을 얻을수 있을 것이다. 약한 산(또는 약한염기)과 그들의 혼합용액은 완충작용이 크다는 것을 알 수 있다.

Serum Protein

Introducton
혈장 성분 중에는 90%~92%는 물이다. 혈장은 무기 및 유기분자들의 혼합물로, 여러 가지 무기이온, 유기영양분, 질소노폐물, 호르몬과 같은 특수산물, 혈장 단백질, 용해된 가스등이 들어 있다. 단백질 성분은 Albumin, Globulin(α,β,γ ), Fibrinogen이 있는데 이 성분들은 단백질에서 Albumin54%,α-Globlin8%, β-Globlin12%, γ-Globlin8%, Fibrinogen18%분포되어 있다. 알부민은 혈류중으로 다양한 화합물이 이동할 때 운반체로 작용하구 교질 삼투압을 유지시킨다. α-글로불린은 면역억제에 관여하며 α2-글로불린은 혈액응고를 방지하고 β-글로블린은 fibrin(plasminogen)을 용해한다. γ-글로블린은 면역반응(면역글로불린)의 기능을 가지고 있다. 혈장 단백질의 γ-글로블린 분획에 포함되는 면역글로불린은 이물질(항원)의 침입에 반응해서 생체 내에서 만들어지는 항체 분자이다.
그 밖에 단백질 혈액 응고 과정에 중요한 fibrinogen이 포함되어 있다. 혈청은 근본적으로 혈장에서 피브리노겐을 제거한 것이다. 혈청 속에 남아있는 여러 가지 단백질을 분비하는 편리한 방법중의 하나는 전기영동법(Electrophoresis)이다.
전기영동이란 하전된 입자가 전기장에서 양극 도는 음극쪽으로 이동하는 현상을 말한다. 이때 이동하는 속도는 입자의 전하량, 크기와 모양, 용액의 pH와 점성도, 용액에 있는 다른 전해질의 농도와 전하량, 지지체의 종류 등 여러 가지 요인에 의해 결정된다. 따라서 어떤 용액과 지지체에서 하전된 입자의 이동속도는 분자 자체의 성질에 따라서 결정된다. 그러므로 전기이동법은 아미노산, 단백질, 핵산들과 같은 하전된 물질들을 분리하는데 매우 효과적인 수단으로 이용된다. 단백질은 모두(-)전하로 하전하지만 어떤 것은 다른 것보다 좀더 강하게 전기를 띤다. 전류가 흐름에 따라서 혈청 단백질은 양극으로 이동한다. 특정 단백질의 음하전정도가 강하면 강할수록 더 빨리 이동한다. 전기영동시료를 분석하면 여러 개의 구별되는 띠(Band)가 나타나는데, 이들은 각각 특수하게 하전된 단백질 분자를 가리킨다. 이 밴드 중에 가장 뚜렷하고 양극에 가장 가까이 이동한 것은 알부민이다. 알부민은 간에서 생성된다. 혈장은 혈액에서 여러 가지 작은 분자를 운반하는 구실도 한다. 알부민 분자는 지방산이 나 담즙색소 그리고 어떤 약품 분자등이 붙을 수 있는 특수한 결합부위를 갖는다. 이러한 물질들은 위와 같은 방법으로 혈액을 통하여 운반된다. 다른 단백질 밴드들은 여러 가지 글로불린이다. 감마-글로불린은 감염이나 면역된 후에 특히 풍부하다. 이는 항체들이 감마-글로불린이기 때문이다.
단백질의 전기영동은 양전하 또는 음전하를 띠기 때문에 여러 종류의 단백질들을 갖고 있는 시료는 중앙에 위치한 홈에 놓아야 하며 이들은 양쪽 방향으로 이동한다. 대부분의 아미노산들이 전하를 띠지 않기 때문에 단위질량당 전하는 매우 적고 단백질의 종류에 따라서 다양하며 또는 단백질들은 형태적으로 다양하다. 그래서 이동속도를 간단하게 예측하는 방법은 없다.

Purpose
햄스터에서 혈청을 추출하여 소와 닭의 알부민위치를 비교하고 전하에 의해 전기영동이 행해지는 원리를 이해하며, 도출된 결과로 혈장내의 단백질 구성성분을 이해하고 각 성분{Albumin, Globulin(α,β,γ )}의 위치를 알아낸다.

Materials and Method

겔은 투명하므로 샘플이 제대로 transfer 되었는지 알 수 없기 때문에 겔을 염색해서 단백질이 제대로 transfer 되었는지를 확인하고 standard size marker의 위치를 표시하기 위해 Poncean S 염색약을 쓴다. sample을 well에 loading 하기위해 200㎕pipetman을 쓴다. Power supply은 전기영동장치에 전류를 공급하기 위해 쓴다. 0.5%Agarose Gel은 가장 많이 이용되는 매체로 투명하여 관찰과 진행이 용이하며 단백질 외에도 RNA, DNA, 플라스미드 등에도 사용된다. buffer 1XTAE 은 전류가 음에서 양으로 이동할 수 있도록 완충작용을 하는데 필요한 재료이다. 원심분리기(Centrifuge)은 혈청은 빨리 얻기 위해 사용한다. epp.tube은 sample을 보관하기 위해 쓴다. marker가 되는 소, 닭의 알부민(50㎎/㎖)을 준비하고 실험 대상인 햄스터의 혈청을 희석하여 준비하는데, sample들이 육안으로 관찰될 수 있도록 Gel loading buffer를 준비한다. 햄스터의 혈청을 1/2, 1/4, 1/6, 1/8로 희석하는 이유는 어느 정도 희석되었을 때 알부민이 잘 보이는 것인지를 알기 위해서다.

두 전극 칸에 완충용액(buffer 1XTAE)을 채운다. tray이 안에서 겔(0.5%Agarose Gel)이 움직이지 않도록 겔에 고정한다. 햄스터의 혈액을 원심분리기(Centrifuge)를 이용하여 5000rpm의 회전 속도로 4℃에서 10분간 돌려 혈청을 얻어낸다. 8개의 tube에 Gel loading buffer라는 혈청 염색약을 각각 3㎕씩 넣는다. 소와 닭의 알부민을 고정된 gel의 첫 번째 well과 두 번째 well에 20㎕피펫을 이용하여 10㎕넣었다. 이때 다른 tube에서 용액을 꺼낼 때 마다 팁을 교체해주고 팁의 끝 부분이 겔을 건드리지 않도록 조심한다.(겔은 얇고 찢어지기 쉬으므로 조심해서 다룬다.) 그런 다음 2번에서 8번 well에는 햄스터의 혈청과 D.W.를 희석(1/2, 1/4, 1/6, 1/8)한 후 이 용액들을 같은 방법으로 차례로 넣는다. 그런 다음 100V이하, 100mA로 40분∼50분 동안 전기 이동시킨다. 전류를 너무 강하게 하면 band가 삐뚤어 지거나 겔 밖으로 벗어날 수 있으므로 buffer에 적합한 전류를 흘려보낸다. running 시키는 동안에는 buffer 상의(-) 와(+)전하에서 기포가 발생하는 것을 볼 수 있을 것이다. 이러면 전류가 제대로 흐르는 것이므로 관찰하다가 band가 어느 정도 transfer되면 전기를 끄고 겔을 분리해서 Ponceau S로 염색한다. 전체적으로 분홍색으로 염색되었으면 D.W.로 겔에서 분홍색빛깔이 없어질 때까지 씻어낸다 . 1, 2번 band에서 소와 닭의 알부민 위치를 확인한 다음 햄스터의 혈청에서 알부민 위치를 관찰한다.

혈청 단백질의 전기영동(Electrophoresis of Serum Protein)(2000. 9. 7)

1. Introduction

Background
Buffers (완충제)
과량의 산과 염기가 가해졌을 때 pH변화를 억제하는 화학계(Chemical system), 또는 수성계(Aqueous system)로 보통 약산으로 만들어진다. 완충제는 제한된 해리특성으로 효과적이며 Buffering region을 갖는다.
약산과 짝염기의 혼합물로 신체 내에서 중요한 작용을 하는데 이를테면 protein, DNA, RNA,등은 pH변화에 민감하기 때문에 인산염과 중탄산염 등을 통해 완충작용을 갖는다.
작용 메카니즘
① [HA]..약산존재 ② 해리(dissociation)가 매우 적게 발생

Purpose
가용동물의 혈액(여기서는 햄스터를 사용)을 추출하여, 단백질의 분자량, 크기, 전하에 의해 전기영동이 행해지는 원리를 이해하며, 도출된 결과로 혈장내의 단백질 구성성분을 이해하고 각 성분이 가지는 전하와 크기 등을 유추한다.

2. Materials and Methods
A. Materials
최초 햄스터와 1㎖ syringe, 헤파린, centrifuge tube는 혈액을 추출하는데 쓰이며, centrifuger와 마이크로 튜브, 마이크로 피펫, 스포이드는 혈장을 분리하는데 사용된다. 필터페이퍼(millipore paper)와 PBS (Phosphate-buff- ered saline), 핀셋(비닐장갑), 전기영동기, Power supply는 마이크로 피펫과 함께 Serum 성분을 loading, 전개하는데 사용된다. 여기서 PBS는 다음과 같이 만든다.

(NaCl 4g + 3x DW 500㎖) (KCl 0.1g + 3x DW 500㎖), (Na₂PO₄ㆍ12H₂O 1.79g + 3x DW 500㎖) (KH₂PO₄0.12g + 3x DW 500㎖)
여기서 각 용액은 최종볼륨(final volume)을 500㎖에 맞추고 HCl로 pH를 7.4로 적정 후 사용한다.
전개가 끝난 필터페이퍼는 염색과 탈색과정을 거치는데 염색용액은 0.25% (w/v) Coomasie Brilliant Blue Stainin으로 methanol 50%, acetic acid 10%, Coomasie Brilliant Blue R 0.05%로 만들고, 탈색용액은(Destaining solution) 단백질 부분의 염색만 남기고 탈색해 주는데 methanol 40%, glacial acid 10%, 3x DW로 final volume 100㎖를 만들어 사용한다. 탈색과정은 3번 거치는데 염색과정까지 총 4개의 containner를 준비하도록 한다.

B. Methods
1㎖ syringe에 혈액응고 방지를 위해 헤파린을 약간 주입하고 햄스터의 좌심방에서 혈액을 채취한다. 햄스터를 잡을 때는 체피를 끌어당겨 채취에 용이토록 한다. 채취한 혈액은 마이크로 튜브에 넣어 5000rpm, 4℃에서 5분간 centrifuge를 해주고 상층부의 Serum만 마이크로 피펫을 통해 micro centrifuge tube에 분리했다.
전개매질은 교재에서 Cellulose acetate를 지정하여 주었으나 편의상 필터페이퍼와 millipore paper를 사용하였다. 이 필터페이퍼를 전기영동기 사이즈에 맞춰 7㎝ 11㎝로 재단한 뒤 장방 모서리 부분을 미리 접어주고 PBS에 기포나 덜 적셔진 부분이 없도록(대각선으로 기울여서 투입) 5분간 담궈둔다. 이 필터페이터를 전기영동기에 loading할 때는 닿는 부분에 기포가 생기지 않도록 충분히 밀착시키고 접힌 양끝단 부분이 PBS액에 충분히 닿도록 setting한다.(PBS는 통상 2/3정도 채운다.) 모든 작업은 핀셋이나 비닐 장갑을 사용하여 손에서 옮겨진 단백질 등의 이물질로 인한 이상 결과 도출을 배제하도록 한다.
기본 setting이 완료되면 spoting을 하는데 200㎕마이크로 피펫을 이용하여 끝단에서 1㎝정도 떨어진 곳에 혈장 5㎕정도를 2군데 떨어트린다. 이때 주의할 점은 타 부위에 혈장이 뭍으면 결과형성에 영향을 미치므로 주의하고 spot에 방울이 있으면 제거하여 준다.
이상여부가 없으면 전기영동기를 가동시키는데 단백질은 음전하를 띈다는것에 유의하여 +,-극을 연결하고 전원을 연결한다. 우리 조는 millipore paper와 함께 진행했는데 필터페이퍼는 50V, 40㎃로 35분간 Running했고 millipore paper는 같은 방법으로 100V, 40㎃에서 45분간 Running시켰다. (millipore paper는 사이즈가 작았기 때문에 양측을 접을 수가 없어 PBS를 충만시켜 setting해야 했다.
각 전개매질은 Coomasie Brilliant Blue Stainin에 5분간 염색한 후 3개의 Destaining solution에서 10분씩 탈색 시켜 주었다.

3. Results
전기영동을 한 햄스터의 혈장 단백질은 길쭉한 띠모양을 생성했으나 혈장을 이루는 각 구성원들의(albumine, α-globulin, β-globulin, γ- globulin, antibodies..) band는 관찰되지 않았고 탈색과정 초기에 전개방향쪽 끝단에 희미한 V자형 band가 관찰되었으나 탈색 종료 후 사라지고 없었다. 필터페이퍼의 경우 spot을 두군데 찍었는데 관찰되는 모양이 상당히 달랐고 millipore paper의 경우 PBS가 증발해버려 타버리고 말았다.

필터페이퍼의 저항값은 1250Ω millipore paper의 저항값은 2500Ω

4. Discussion
실험결과는 교재의 예처럼 성분별로 밴드를 이루는 뚜렷한 구분이 불가능했다. 보통 running은 몇 시간 씩 걸어두는데 이번 실험은 전기영동기가 부족한 관계로 여러 조가 함께 써야 했기에 시간 소모가 많았다. 따라서 좀더 오랜 시간을 실행했다면 밴드를 관찰할 수 있었을 것이다. 전개속도에 밀접한 영향을 미치는 전압도 2개의 power중 1개는 조정이 불가능하여 50V이상 높일 수 없었다. 전압이 높았더라면 좀더 길게 running되어 뚜렷한 결과를 얻을 수 있었을 것이다.
최초, 필터페이퍼에 로딩한 두 spot의 양은 거의 같았으나 두 spot의 전개모양과 길이는 상당한 차이를 보였는데 전개매질의 적셔진 정도가 다르고(전류는 저항이 적은 쪽으로 이동) 혈장의 성분, 내지는 불순물이 고르지 않게 포함되어 있어 이런 결과를 보인 것 같다. 또한 염색 당시 보였던 전개방향의 V모양 얼룩은 양쪽에서 동시에 관찰된 것으로 보아 실험상의 실수는 아닌 것 같고 Serum의 구성성분인 것 같다. 그 양이 매우 미미한 것으로 보아 호르몬이나 그외 미량의 원소가 아닌가 추측된다.
millipore paper는 내부의 구멍이 작기 때문에 확실한 실험결과를 도출할 수 있어 내심 기대했으나 저항에 의해 발생된 열로 buffer가 증발해 타버리고 말았다. 만약 성공했다면 두 전개매질의 결과 비교와 함께 밴드를 관찰할 수 있었을 것이다.
복학 후 처음한 실험이었다. 시간의 공백이 너무 큰 것 같아 기본지식의 습득이 시급하다고 생각되어진다. 다음 실험부터는 시간에 쫓기면서 급하게 하기보다, 여유를 갖고 이해하면서 진행하였으면 하는 바램이 있다.

5. References
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Lehninger ·Nelson·Cox, 제6장 단백질 서론, 薺節　, 주식회사 서울외국서적, 1996년 8월 31일, pp147∼150
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전기 영동법

원리
전기영동은 전기장 안에서 하전된 입자가 양극 또는 음극 쪽으로 이동하는 현상을 말한다. 이 때 이동하는 속도는 입자의 전하량, 크기와 모양, 용액의 pH와 점성도, 용액에 있는 다른 전해질의 농도와 이온의 세기, 지지체의 종류 등 여러 가지 요인에 의해 결정된다. 따라서, 어떤 용액에서의 하전된 알맹이의 이동속도는 분자 자체의 성질에 따라서 결정된다. 그러므로 전기영동법은 아미노산, 뉴클레오티드, 단백질 들과 같은 하전된 물질들을 분리하거나 분석하는 데 매우 효과적인 수단으로 이용된다.

전기영동법의 종류
이동계면 전기영동법 (Moving boundary electrophoresis)
전기영동법은 크게 두 가지 유형으로 구분할 수 있다. 하나는 이동계면 전기영동법으로서, 분리하고자 하는 분자들이 용액 내에 산재해 있는 상태에서 전류를 통하여 용매와 용액사이 또는 용액과 용액사이에 계면을 이루게 하는 전기영동법이다. 이동계면 전기영동법에서 계면의 이동은 용액에다 빛을 통과시키고 그 결과를 사진으로 만들어서 조사할 수 있다. 이동계면 전기이동법은 이론상 매우 복잡하여 결과를 해석하는 데 어려운 점이 많다는 것이 단점이다.
띠 전기영동법 (Zone electrophoresis)
이 방법에서는 적은 양의 시료용액을 거름종이, 아세트산 셀룰로오스 종이, 폴리아크릴아미드 겔, 한천 겔, 녹말 겔 따위의 지지체에 실은 후 전류를 통하여 주면 시료의 성분들이 점 또는 띠를 이루면서 이동한다. ぢ전기영동그림っ을 만듦으로써 시료에 있는 성분들을 육안으로 확인 할 수 있고, 또한 광도계를 써서 정량할 수도 있다. 때 전기영동법의 경우에는 실험 목적에 따라 적당한 지지체를 선택하여야 분리를 효과적으로 할 수 있다.

1. 거름 종이
종이는 값이 싸고 사용하기 편리한 지지체이다. 그러나 분리하려는 물질들이 셀룰로오스에 흡착이 잘 되어서 전기영동그림의 띠들 사이의 경계가 선명하지 못한 것이 결점이다.
2. 아세트산 셀룰로오스
이 지지체는 아세트산 셀룰로오스의 히드록시기를 아세틸화한 것으로서 헙착성이 약하고 물질을 분리하는 데 시간이 짧다. 성분들이 거름종이에 있어서보다 깨끗이 분리되므로 검출하기가 쉽다. 또 아세트산 셀룰로오스는 여러 용매에 쉽게 용해되므로 빠르고 쉽게 회수할 수 있는 장점이다.
3. 한천 겔
이 지지체는 투명하기 때문에 특히 광도계를 쓰는 측정에 적당하며 사용이 간편하다. 특히 슬라이드를 이용하는 면역 전기영동법에 많이 사용되면 한천 겔에서 아가로펙틴(agaropectin)을 제거한 아가로오스(agarose)는 최근에 DNA, RNA 및 플라스미드 등을 분리하는 데 유용하게 쓰인다.
4. 녹말 겔
이 지지체는 녹말을 가열하여 그 알맹이가 파괴되어 겔이 형성될 때 까지 부분가수분해시킨 것이다. 녹말 겔의 구멍의 크기는 녹말의 종류, 완충용액의 종류 및 pH에 따라 결정되면 분자를 거르는 체의 구실을 한다. 한천 겔을 쓸 경우보다 시료가 많이 필요하고, 분리된 물질을 용출하기 어려운 것이 결점이지만 여러 동질효소(isoenzyme)를 분리하는 데에 널리 사용되고 있다.
5. 아크릴아미드 겔
서로 다른 그물조직을 가진 두 가지 아크릴아미드 겔을 포개어 불연속적인 층을 이루게 하여 사용한다. 이 경우 지지체의 그물조직의 구멍의 크기는 아크릴아미드의 농도를 변화시킴으로써 임의로 바꿀 수가 있다. 상층의 덜 촘촘한 겔은 단백질 같은 하전된 알맹이를 농축하는 역할을 하는 치쌓임겔(stacking gel)이므로 이 부분을 통과한 시료는 뚜렷한 때를 형성한다. 아크릴아미드 겔은 성분들의 전하에 따라서 분리할 수 있을 뿐 아니라 분자를 질량에만 의존하는 분리가 가능하다. 오늘날 아크릴아미드 겔은 단백질의 분리, 정제한 단백질의 순도 검정, 단백질의 분자량 측정 그리고 DNA의 염기 결합순서 결정 등에 이용되고 있다. 아크릴아미드 겔 전기영동법은 소량의 시료를 사용하여 단시간에 시료 혼합물을 분리할 수 있는 장점이 있다.

불연속 겔 전기영동법 (Disc-gel electrophoresis)
불연속 겔 전기영동법은 아크릴아미드 겔을 이용하여 단백질들과 같은 하전된 알맹이가 매우 뚜렷한 띠들로 분리될 수 있도록 띠 전기영동법을 변형한 방법이다. 불연속 겔 전기영동법과 띠 전기영동법과의 중요한 차이점은 두 가지 겔(치쌓임 겔, 분리 겔)를 사용한다는 것과 겔 지지체와 완충용액 탱크에 사용하는 완충계들이 다르다는 것이다. 이 전기영동법을 불연속 겔 전기영동법이라고 부르는 이유는 두 겔계에 사용한 수소 이온 농도, 이온의 세기, 완충용액의 조성 및 겔 농도 등이 불연석적이기 때문이다. 불연속 겔 전기영동법에 사용하는 폴리아크릴아미드는 아크릴아미드와 N, N,N',N'-테느라에틸렌디아민(TEMED)을 첨가한다.
치쌓임겔은 아크릴아미드의 농도가 더 낮으며, 더 낮은 이온의 세기의 완충용액으로 제조되며, 따라서 pH도 더 낮다는 점에서 분리겔과 다르다. 첫 두 요인들에 의해서 단백질 분자들의 치쌓임겔에서의 이동은 분리겔에서의 이동보다 더 빨라진다. 그 이유는 첫째, 구멍 크기가 더 큼으로써(농도가 작은 겔에서) 이동하고 있는 분자들에 대한 물리적인 저항이 작기 때문이고, 둘째, 이온의 세기가 작으면 전기적 저항이 더 커지고 따라서 전기장의 세기(volts/cm)가 더 커지기 때문이다.
시료층에 있어서는 세 가지 음이온들, 즉 염하이온, 글리신 및 단백질들이 양극 쪽으로 이동하고 있다. pH8.3에서 글리신의 알짜전하는 염화이온의 전하(-1)의 몇 분의 일이다. 글리신은 염화이온보다 더 크기 때문에 더 많은 저항을 받는다. 이 두 가지 이유로 염화이온들은 글리신보다 더 빨리 이동하려 할 것이다. 그러나 전류, 즉 이온들의 흐름은 게 전체에 걸쳐서 같아야 하므로 모든 이온들은 같은 속도로 움직인다. 그러기 위해서는 전압이 염화이온 부분에 있어서보다 글리신 부분에 있어서 훨씬 더 커야 한다. 이렇게 해서 생긴 전압의 불연속성은 염화이온과 글리신 이온을 분리하게 될 것이다. 염화이온과 글리신 이온의 이동속도의 중간의 속도를 가지는 단백즐들은 글리신 이온과 염화이온이 있는 부분들 사이에 오게 될 것이다. 그뿐 아니라 단백질의 전하/질량비는 글리신 이온이나 염화이온보다 휠씬 작으므로 글리신 이온이나 염화이온 용액들이 지니는 만큼의 전류를 지니기 위해서는 매우 좁은 띠들에 농축되어야 한다. 그래서 단백즐의 띠 형성이 시작되게 된다.

SDS겔 전기영동법
황산도데실나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(SDS-PAGE)도 역시 유용한 전기영동법의 한 가지이다. 이 방법은 특히 단백질이 단위체인지 아닌면 중합체인지를 결정할 때와, 소중합체를 구성하는 소단위체들의 수와 크기를 결정할 때 유용하게 사용한다.
SDS-PAGE는 중성 pH에서 황산도데실나트륨(SDS)과 ?-메르캅토에탄올이 전재하는 조건에서 수행된다. SDS는 단백질과 결합하여 단백질의 규칙적인 삼차구조를 파괴하여 불규칙하고 무작정한 코일구조를 가지게 한다. 만일 단백질이 소중합체일 경우에는 구성 단위체들로 해리시킨 후 불규칙한 코일구조를 가지게 한다. SDS와 단백질과의 이러한 작용은 단백질의 사슬내에 있는 이황화물 다리결합 또는 사슬들 사이의 이황화물 다리결합을 환원시키는 ?-메르캅토에탄올에 의하여 촉진된다. SDS가 단백질과 결합하여 단백질 복합체가 되면 단백질이 지니는 음전하는 SDS가 가진 음이온에 기인되는 것이 대부분이다. 중성 pH에서는 단백질 자체의 전하가 극소화되기 때문에 이 경우에는 단백질이 띠게되는 음전하는 단백질에 결합한 SDS에서 오는 음전하뿐이다. 종류가 다른 모든 단백질들에 대하여 SDS는 단위 무게당 일정한 양(1.4g SDS/g단백질)이 결합하므로 SDS-단백질 복합체는 질량에 대한 전하의 비가 일정하게 된다. 또한 SDS-단백질 복합체는 모두 불규칙한 코일구조를 가지고 있으므로 마찰계수도 동일하다. 그러므로 SDS-단백질 복합체의 전기이동속도는 겔의 체 효과에 의해서만 좌우되며, SDS-단백질 복합체이 크기가 클수록 확산계수가 작아서 이동속도가 작아지게 된다.

아가로오스 겔 전기영동법
DNA를 분리,정제하여 확인하는 방법으로는 아가로스 겔을 이용하는 전기영동법이 보편적으로 사용된다.
이 방법은 간단하고 소요되는 시간이 짧을 뿐 아니라 밀도, 기울기, 원심분리법으로는 분리할 수 없는 DNA조각들의 혼합물을 분리할 수 있다. 그뿐만 아니라 겔 상에서 DNA는 브롬화에티듐(ethidium bromide)과 같은 형광성 시약으로 처리하면 염색되므로 자외선 하에서 DNA를 직접 관찰할 수 있다.아가로오스 겔을 통한 DNA의 이동속도는 DNA 분자의 크기, 아가로오스의 농도, DNA의 형태, 전류의 세기, 염기 조성 및 온도 등에 좌우된다.

단백질 정제

모든 단백질들을 정제하는 한 가지 간단한 방법은 없다. 한 단백질의 정제에 유용한 방법은 또 다른 단백질의 변성을 가져올 수 있다. 단백질 정제에 있어서는 조잡한 단백질 혼합물에 있는 여러 단백질들의 물리적 및 화학적 성질들에 있어서의 근소한 차이를 이용한다. 이러한 차이점들의 정확한 본질을 미리 알고 있지 못하기 때문에 정제방법은 필연적으로 시행착오를 통해서 알게 된다. 세포에서 한 가지 균일한 단백질을 얻으려면 보통 다음과 같은 많은 방법들을 순차적으로 응용해 보아야 한다.

용해성
수용액에 있어서의 단백질들의 용해도는 극성인 물 분자들과 단백질 분자들의 이온화된 원자단들 사이의 친수성 상호작용에 따라서 결정된다. 그러므로, 수용액의 유전상수 또는 이온의 세기를 변화시킬 수 있는 시약들은 단백질의 용해도 에 영향을 미칠 것이다. 단백질의 변성을 피할 수 있는 낮은 온도에서 에탄올, 아세톤, 또는 황산암모늄과 같은 염들을 첨가하면 단백질이 침전된다. 이러한 기법들을 단계적으로 사용함으로써 단백질 혼합액에 있는 단백질들을 분별침전시킬 수 있다.

흡착성
단백질은 어떤 pH와 이온의 세기의 조건에서 여러 가지 물질들에 의해서 흡착된다. 예를 들면 인산칼슘 겔과 알루미나 겔이 여러 가지 단백질들의 혼합물로부터 특정한 단백질을 흡착하는 데 자주 사용된다. 겔에 흡착된 단백질들은 pH를 바꾸거나 이온의 세기를 증가시킴으로써 유리시킬 수 있다. 그러므로 겔을 가지고 필요없는 단백질을 제거하거나 원하는 단백질을 분리함으로써 정제할 수 있다.

크로마토그래피를 이용한 분리
여러 가지 전해질인 단백질들은 이온교환 크로마토그래피로 분리할 수 있다. 가장 일반적으로 사용되는 이온교환수지는 셀룰로오스, 덱스트란, 아가로오스 및 폴리아크릴아미드의 유도체들이다. 가장 흔히 사용되고 있는 음이온교환 수지들은 디에틸아미노에틸(DEAE)또는 트리에틸아미노에틸(TEAE)기들로 치환된 것들이며 유용한 양이온교환수지들은 카르복시메틸(CM), 포스포릴(P),또는 술포에틸(SE)기들로 치환된 유도체들이다.
덱스트란, 아가로오스 및 폴리아크릴아미드 상에서의 겔 배제 크로마토그래피도 단백질들의 분리에 많이 사용되고 있다. 단백질 혼합물을 이온교환수지 대롱에서 훌륭하게 분리하기 위해서는 시료를 단계적으로 또는 농도기울기를 사용하여 용리 하는 것이 보통이다.
그밖에 겔 거르기 크로마토그래피를 이용하여 분자의 크기에 따라서 분리하는 방법도 흔히 사용된다.
기질 또는 방해물질과 같은 특이한 분자들에 대한 효소(또는 단백질)의 자연적인 친화성을 이용하는 친화 크로마토그래피가 매우 유용하게 사용된다. 단백질과 결합하는 분자를 아가로오스와 같은 비불용성인 지지체에 공유결합으로 결합시킨다. 다음에 이것을 적당한 단백질을 선택적으로 흡착하는 지지체로 사용한다.

전기영동법에 의한 분리
단백질들의 알짜 전하는 그즐이 용해된 매질의 pH에 따라서 변한다. 따라서, 완총용액에 용해된 단백질 용액에 전기장을 가하면 단백질들은 차별적인 이동을 하게 된다. 흔히 사용되는 방법은 폴리아크릴아미드 겔을 이용한 전기영동법이다.

단백질의 정량

모든 종류의 단백질의 농도를 결정할 수 있는 완벽한 방법은 지금까지 알려져있지 않다. 따라서 단백질의 양을 정량하기 위해서는 단백질의 본질, 단백질 시료에 있는 다른 성분들의 본질, 정량분석의 신속도, 및 정밀도 등에 따라서 적당한 방법을 선택하여야 한다.

뷰렛 시험 (biuret test)
두개 이상의 펩티드 결합을 가지고 있는 화합물들은 알칼리성 용액에서 묽은 황산구리로 처리하면 자주색을 띠는 물질을 생성한다. 색깔은 구리원자와 두 개의 펩티드 사슬에서 오는 네 개의 질소원자들 사이에서 배위화합물이 형성됨으로써 생기는 것으로 생각되고 있다. 뷰렛 시험은 모든 단백질에 대해서 재현성이 꽤 좋으나 비교적 많은 양(1내지 20mg)의 단백질을 정량하는 데 쓰이는 방법이다.

Lowry 시험(Folin-Ciocalteau )
Lowry등이 고안한 이 단백질 정량분석법은 용액에 있는 단백질뿐 아니라 건조된 시료에도 이용될 수 있다. 특히 이 정량방법은 5ug/ml정도의 단백질 양을 정량할 수 있는 대단히 민감한 방법이어서 널리 쓰이고 있다. 이 Lowry 방법에서 사용하는 Folin-Ciocalteau시약에 의한 발색은 뷰렛 시험에서와 마찬가지로 단백질과 알칼리성 구리와의 반응과 포스포몰리브덴산-포스포텅스텐산 염들이 단백질에 있는 티로신과 트립토판 들에 의한 환원반응으로 생긴다. 이 두 아미노산의 함량은 단백질의 종류에 따라서 상당히 다르므로 1mg의 단백질에 대한 색의 세기가 일정하지가 않다. 표준곡선을 결정하는 데 사용한 단백질이 나타내는 색의 세기와 다를 수 있다. 그럼에도 불구하고 이 방법은 단백질을 정제하는 과정에 있어서 단백질의 함량변화를 측정하는 데는 매우 유용한 방법이다.

분광학적 정량법
단백질에 있는 티로신, 페닐알라닌 및 트립토판 잔기들은 각각 275nm와 280nm의 자외선을 흡수한다. 많은 단백질들에 있어서의 이 아미노산들의 합친 수준은 거의 일정하므로 단백질의 농도는 280nm에서의 흡광도와 비례하게 된다. 물론 예외가 있기는 하지마 순수한 단백질의 경우 단백질의 농도가 1mg/ml이고 자외선이 통과하는 경로가 1cm일 때 280nm에서의 흡광도는 1.0이다. 따라서 대부분의 순수한 단백질의 농도는 280nm에서의 흡광도를 측장함으로써 신속히 결정할 수 있다. 이 방법은 정량하는 데 시간이 적게 들 뿐만 아니라 정량하고 난 후의 단백질을 환전히 회수하여 재이용할 수 있는 이점이 있다.

유감스럽게도 자연물들에는 280nm에서 흡광을 나타내는 그밖의 화합물들이 많이 있다. 특히 핵산은 260nm에서 최대 흡수를 가지고 있지만 280nm에서도 흡광도가 상당히 크다. 그러 A280/A260을 알면 280nm에서의 핵산의 흡광에 대한 보정을 할 수 있다.

광합성색소 [光合成色素, photosynthetic pigment]

광합성을 하는 생물에서 광합성의 에너지원인 햇빛을 흡수하는 여러 가지 색소.
동화색소라고도 한다. 광합성 생물에는 고등녹색식물, 녹조류, 갈조류, 홍조류, 차축조류, 광합성세균이 있다. 고등녹색식물과 여러 가지 조류는 엽록소a가, 광합성세균은 세균엽록소a가 중요한 광합성색소이며, 이 밖에도 엽록소 b, c, d, e와 세균엽록소 b, c, d가 있다. 광합성 색소는 광합성 생물과 함께 진화했으며, 광합성생물의 유연관계와 계통에 따라 광합성색소의 비율도 다르다.
엽록소 이외의 광합성색소로는 노란색과 붉은색을 띤 카로티노이드와 조류에 들어 있는 피코빌린이 있다. 고등식물의 엽록체 속에는 엽록소a와 b가 대개 3:1로 들어 있고, 엽록소 a와 b의 분자 속에는 마그네슘 원자가 1개 들어 있다. 광합성 생물의 엽록소a와 광합성세균의 세균엽록소a 이외의 광합성색소를 보조색소라고 하는데, 보조색소는 빛을 받아서 광합성을 진행시키는 반응중심에 빛에너지를 전달하는 구실을 한다.
http://100.empas.com/entry.html

1.기능으로 분류
(1)안테나 색소:빛에너지를 흡수하여 반응 중심 색소로 에너지를 전달하는 색소.
광수확안테나(light-harvesting antenna)라고도 하며 수 백개의 엽록소a, 엽록소b, 카로티노이드 색소가 단백질과 결합되어 있으며, 대부분의 에너지를 반응 중심 색소로 보낸다.
(2)반응중심색소:고에너지 전자를 방출하는 색소로 한 분자의 엽록소a와 단백질로 구성되어 있으며 이 단백질은 전자전달계와 매우 밀접하게 연결되어 있다.
1)광계Ⅰ:최대 흡수파장이 700nm인 엽록소a(P700)이 반응 중심색소인 광계
2)광계Ⅱ:최대 흡수파장이 680nm인 엽록소a(P680)이 반응 중심색소인 광계

2.엽록소: 육상식물의 경우 엽록소a와 엽록소b 가 약 3:1 로 분포

3.보조색소:카로틴과 크산토필
(1) 안테나 색소 역할
(2) 과도한 빛에너지로부터 엽록소 보호

4.흡수스펙트럼:색소를 추출하여 파장별로 흡광도를 조사한 것.
5.작용스펙트럼:파장별로 잎의 광합성 속도를 비교한 것.
http://mail.jamsin.or.kr/leesi/물질대사/광합성/광합성%20색소.htm

방법: 광합성색소(chlorophyll a, b, c)는 Murphy와 Rily (1962)의 방법을 Strickland와 Parson (1972)이 실용화한 방법을 이용해 분석하였다. 광합성색소를 측정하기 위한 시료는 일정량의 해수를 GF/C filter로 여과해 색소의 산화방지를 위해 MgCO3로 전처리한 후, dry ice로 급속냉동시켜 실험실로 옮겨와 분석하였다. 시료는 90% acetone 처리 24시간 후, 4000 rpm으로 20분간 원심분리 한 후, 침전시킨 색소를 추출하여 spectrophotometer (Cary 50 Cons, Varian)로 측정하였다. 광합성 색소량은 Jeffrey (1976)식에 의해 산출하였다.
http://my.dreamwiz.com/doochee/ull1.htm3.

광합성 색소와 빛의 흡수율
녹색잎으로부터 광합성 색소를 추출하여 여기에 프리즘으로 분광된 빛을 비추면 어떤 빛을 잘 흡수하는가 하는 흡수 스펙트럼을 얻을 수 있는데, 이에 의하면 엽록소의 경우 청자색광(400-500nm)과 적색광(600-700nm)의 빛을 잘 흡수하는 것을 알 수 있다. 한편, 엽록체 또는 식물에 여러 파장의 빛을 비추어 파장별 광합성 효율을 조사하면 광합성의 작용 스펙트럼을 얻을 수 있다. 이 것을 흡수 스펙트럼과 비교하면 두 그래프가 유사함을 알 수 있고, 이 사실을 통해 엽록소가 빛 에너지를 흡수하여 광합성에 이용하는 주 색소임을 추정할 수 있다.
다만, 흡수 스펙트럼의 경우 녹색광(500-600nm)에서 값이 0에 가까우나 작용 스펙트럼에서는 약간의 값이 나타나는 것으로 보아 엽록소 이외의 색소가 광합성에 보조역할을 하고 있으며, 이 색소의 흡수 스펙트럼은 녹색광에서 높은 값을 나타낼 것이란 사실을 알 수 있다.
http://moolynaru.knu.ac.kr/everyday_science/energe/11.guanghabsung/heubsooyuol.htm

광합성색소 [光合成色素, photosynthetic pigment]광합성과 이산화탄소와의 관계
광합성이란 무엇이며, 광합성작용은 잎에서 어떻게 일어나는 것일까?
광합성에 필요한 환경요인은 빛, 이산화탄소, 온도이다.
빛과 온도가 일정할 때, 이산화탄소의 양과 광합성과의 관계는 어떠한가?
1. 광합성에 반드시 이산화탄소가 필요하다는 것을 안다.
2. 이산화탄소의 양에 따른 광합성량을 측정할 수 있다.
3. 엽록체에서 일어나는 광합성과 그 결과 만들어진 동화양분의 이동과 저장에 대해서 알 수 있다.
실험 1. 광합성에는 이산화탄소가 필요한가?
나팔꽃(화분의 것), 수산화나트륨, 에탄올, 요오드용액, 비커(100, 200, 300 ㎖), 유리막대, 가열기구, 샬레, 비닐봉지(투명한 것), 약포지
1. 10%의 수산화칼륨 용액을 만든다.
2. 나팔꽃 가지에 비닐봉지를 씌우고 밝은 곳에 둔다.
① 한 쪽은 수산화칼륨 용액이 담긴 비커와 같이 씌우고 다른 쪽을 가지만 씌운다.
② 공기의 출입이 없도록 비닐봉지의 주둥이를 단단히 매고, 남쪽 방향의 유리 안쪽에 1주일을 둔다(유리창의 색깔은 젖빛유리를 사용한다) .
* A의 폴리봉지 안에 수산화칼륨 수용액을 넣는다.
* 공기의 출입이 없도록 폴리봉지의 주둥이를 단단히 처매고, 남쪽면으로 한 젖빛유리 안쪽에 1주야 이상 둔다.
3. 2개의 비닐봉지속의 잎을 1장씩 따서 뜨거운 물에 넣어 세포를 죽인 후 에탄올로 엽록소를 녹여 내고, 물에 넣어 편 다음 요오드 용액을 바른다.

(결과)
▶ 각 잎의 색깔 변화를 관찰하여 기록해보자.
(정리)
1. 어느 잎에서 광합성이 잘 일어났는가?
2. 왜 수산화칼륨을 넣어 두었는가?
3. 광합성이 잘 일어난 잎은 요오드 용액과의 반응에서 어떤 색깔을 띄는가?

실험 2. 이산화탄소량과 광합성량은 어떤 관계가 있는가?
(준비물)
물풀 (검정말 혹은 카나다말) , 대형시험관, 가열기구, 유리관 , 형광등 (20W)
(실험과정)
1. 대형 시험관에 여러 가지 물을 준비한다.
① 끓인 다음 식힌 더운 물, 수돗물, 2-3분간 숨을 불어 넣은 수돗물을 준비한다.
② 식힌 더운 물은 시험관에서 옮겨 붓지 않도록 한다.
2. 물풀을 넣고 빛을 쬐고서 기포수를 비교한다.
* 물풀은 자른면이 위로 가게 한다.
* 1분간에 발생하는 기포수를 센다.
(정리)
1. 어느 시험관의 물풀에서 가장 많은 기포가 발생하였는가? 또 기포는 무슨 기체인가?
2. 왜 더운 물을 식힌 다음 다른 시험관에 옮겨 붓지 않는가?
3. 숨을 불어넣는 방법 이외에 이산화탄소를 공급하는 다른 방법은 없겠는가?
(결론)
1. 광합성에는 반드시 이산화탄소가 필요하다.
2. 이산화탄소량이 많은 쪽이 광합성이 왕성하다.
http://gsce.gsnu.ac.kr/~edubio/gifted/theme03/theme03.html2)

광합성 색소
    ① 엽록소 : a, b, c, d
        a : b = 3 : 1
        갈조류, 규조류 : a + c
        홍조류 : a + d
    ② 카로티노이드계 색소 : 보조 색소
        카로틴, 크산토필
* 광합성 색소 분리
1. 종이 크로마토 그래피 이용
2. 전개율
3. 색소 추출액 -- 메탄올 : 아세톤 = 3 : 1
4. 색소 전개액 -- 톨루엔, 크실렌
http://user.chollian.net/~jin9964/biology/photo.htm#광합성과 엽록체.

광합성 색소
식물체의 엽록체에는 광합성에 관여하는 색소로서 엽록소, 엽록소, 카로티노이드(카로틴과 크산토필) 등이 있으며, 하등 식물이나 세균등에는 갈조소, 홍조소, 남조소 등이 있다. 또, 액포에는 광합성에 관계없는 색소인 안토시안 등이 들어있다.
1) 엽록소 : 대표적인 광합성 색소로서 고등식물에서는 엽록소 a와 b가 약 3:1의 비율로 존재한다. 엽록소에는 a, b 이외에 c, d, e 등이 있으나, 엽록소 a는 광합성을 하는 모든 식물에서 발견되며, 이런 점으로 보아 광합성 색소 가운데서도 중심적인 역할을 하는 것은 엽록소 a로 볼 수 있다. 엽록소 a 중에서 명반응의 중심 색소로 작용하는 것에 대해서는 이용하는 빛의 파장에 따라 P680, P700 등의 명칭을 붙이기도 한다. 엽록소의 분자 구조는 적혈구 속에 들어 있는 헤모글로빈의 헴 색소와 유사하여, 헴의 중심원소가 Fe인데 반해서 엽록소는 Mg인 것만 다르다.
  2) 카로티노이드계 색소 : 고등 식물에는 엽록소 외에 카로틴이나 크산토필 같은 카로티노이드계 색소가 함께 들어 있어서 광합성에 관여한다. 여러 실험의 결과로 보아 이들 색소는 빛에너지를 흡수하여 엽록소에 넘겨주는 것으로 생각되며, 엽록소 없이 이들만으로는 광합성이 일어나지 않는 것으로 보아 이들은 광합성에 직접 관여하지는 않는 것으로 판단된다.
  3) 식물이 녹색을 띠는 이유는 적색과 청자색광을 잘 흡수하고 녹색광을 반사하기 때문이다.
  4) 단풍이 드는 이유 : 가을에 잎이 붉거나 노랗게 변하는 것은 기온이 낮아지면 엽록소가 분해되고 카로티노이드계 색소나 안토시아닌 등의 색소가 돋보이기 때문이다.
http://moolynaru.knu.ac.kr/everyday_science/energe/11.guanghabsung/saekso.htm

PCR

종합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction)은 특정 DNA 부위를 특이적으로 반복 합성하여 시험관내에서 원하는 DNA 분자를 증폭시키는 방법으로서, 아주 적은양의 DNA를 이용하여 많은 양의 DNA 합성이 가능하므로 분자 생물학적으로 제한효소의 발견만큼 획기적인 것이라 할 수 있다. 즉 genomic DNA와 같은 아주 큰 DNA로부터 DNA 부분만을 선택적으로 증폭시킨 후 일반적으로 사용되는 agarose gel이나 polyacylamide gel 상에서 뚜렷하게 보이는 band로 가시화 할 수 있다.

PCR이 이용되는 실험
1) Probe로 사용할 목적으로 cloning된 이중가닥 DNA의 증폭
2) 적은 양의 mRNA로부터 특정 cDNA의 cloning
3) DNA sequencing
4) 돌연변이 검사
5) 병원성 바이러스 및 박테리아 검출
6) 유전자의 footprinting
7) 특정 부위에 돌연변이를 일으킬 유전자 제조(site direct mutagensis)

PCR 반응의 세 단계
1) DNA의 변성
90℃∼96℃로 가열하여 double strand DNA를 single strand DNA로 뷴리 시킨다. 높은 온도일수록 ssDNA로 잘 이행되지만 Taq DNA polymerase도 온도가 아주 높은 상태에서는 활성도가 낮아질 수 있으므로 보통 94℃로 쓴다. Cycle의 처음은 확실한 변성을 위하여 약5분간 시간을 주어야 한다.
2) Primer의 결합(annealing)
50℃∼65℃에서 진행되며, 염기간에 G와 C는 세군데에서 수소결합이 일어나고, A와 T는 두군데에서 결합이 일어나므로 G+C 비율에 따라 결합온도에 변화를 주어야 한다. 비특이 PCR산물이 형성되는 경우 결합온도를 올려서 반응시켜 보면 이 산물을 줄이는데 도움을 줄 수 있다.
3) DNA의 합성
70℃∼74℃에서 시행하며 원하는 PCR 산물의 크기가 크거나 반응요소의 온도가 낮을 때에는 시간을 연장시키는 것이 좋다. Taq DNA polymerase는 보통 1분에 2,000∼4,000 nucleotides를 합성할 수 있으므로 원하는 PCR 산불의 크기 1 kb마다 1분 정도의 시간을 배당하면 충분히 반응이 일어날 수 있다. Cycle이 계속되면서 효소의 활성이 감소할 수 있고 DNA 산물은 점점 많이 존재하게 되므로 cycle 후반부에는 반응 시간을 조금씩 늘려가는 것도 좋은 방법의 하나이며, 마지막 cycle에는 시간을 충분히(10분)효소의 활성이 충분히 발휘되도록 한다.

Genomic DNA로부터 특정 유전자 부위의 증폭

실험방법
1. 실험에 이용할 PCR tube에 다음과 같이 실험에 사용할 재료들을 혼합하고 pipette으로 잘 섞는다.
                Template DNA(100ng/㎕)                   1㎕
                Upstream primer(12.5 pmole/㎕)           1㎕
                Downstream primer(12.5 pmole/㎕)         1㎕
                dNTP(dA,dG,dT,2.5mM-each)                 2㎕
                10x PCR buffer                           5㎕
                D.W                                      39㎕
                Taq DNA polymerase(1 unit/㎕)            1㎕       (총 부피 50㎕)
2. 혼합한 시료를 PCR기계에 넣고 다름과 같은 program으로 PCR을 실행한다.

PCR의 응용
RT-PCR(Reverse Transcriptase Polymerase Chain Rection)
특정 부위의 RNA를 Template로 하여 상응하는 cDNA를 합성한 다음 이를 응용하여 PCR증폭을 시행하는 기술이다. 실험과정은 1)역전사효소를 이용하여 RNA로부터 cDNA를 제조하는 과정과 2)cDNA를 이용하여 특정부위를 증폭시키는 과정으로 나뉘어지며, (2)과정은 genomic DNA로부터 특정 유전자 부위를 증폭시키는 방법과 같다. 이 방법은 Northern blot hybridization과 같은 방법을 통해 가능하던 RNA 분석보다 실험방법이 더욱 간단할 뿐 아니라 유전자의 염기서열 결정이 가능하기 때문에 주로 mRNA의 염기서열 및 전사량을 연구할 때 크게 도움이 된다. 염기서열이 알려진 유전자의 RT-PCR을 통하여 전체 길이의 cDNA를 간단히 합성하여 cloning할 수 있다.

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